Praktische aspekten van microbiologisch monitoring

Micro-organismen veroorzaken neerslag en corrosie en verhinderen het vrij stromen van water. Het in de hand houden van deze organismen is absoluut noodzakelijk. Dit artikel behandelt de praktische problemen van microbiologische analyse.

Artikel gepubliceerd in Corrosie nummer 5 1990.

Inleiding

Microbiologische neerslag in een koelsysteem kan een erg ingewikkeld en frustrerend probleem zijn. Natuurlijk reiken de milieu-aspekten van een bepaald produkt verder dan alleen de microbiologische controlemogelijkheden die het produkt bezit. Men dient te weten waar het behandelde water heengaat nadat het het koelwatersysteem verlaten heeft. De voornaamste koelingsproblemen zijn microben slijm, sulfaatreductoren, algen en schimmels. De rol van microbiologisch monitoring is gemakkelijk te definiëren. We moeten de micro-organismen die een nadelige invloed hebben op de proces-efficiëntie opsporen en identificeren. We willen het gedrag van deze organismen in koelsystemen bestuderen om hun individuele biologische groeiwijze te kunnen vaststellen. We moeten een effektieve behandelingsstrategie bepalen - er rekening mee houdend dat de toepassing van geschikte biociden slechts één aspekt kan zijn van een complex behandelingsprogramma, dat zelf weer nieuwe problemen kan opwerpen. Tenslotte moeten we voortdurend de gekozen behandeling in de gaten houden en evalueren, om een blijvende effektiviteit te waarborgen en om een optimale balans te bereiken tussen kosten en baten.

Helaas doen er zich enkele praktische problemen voor bij deze specifieke toepassing van microbiologische analyse. Aan de ene kant vereist microbiologisch onderzoek verfijnde apparatuur, getraind personeel en een beheersbaar laboratorium-milieu. Dit kan waarschijnlijk het best worden bereikt met een op ware grootte werkend gecentraliseerd laboratorium. Aan de andere kant hangt de effektiviteit van de analyse af van de mogelijkheid om individuele procescondities te herhalen, bij regelmatige proefnemingen en van een snelle respons als we het risico van organische veranderingen in de proeven willen verkleinen. Hieraan wordt het best voldaan door ter plekke te meten. Omdat voor het merendeel van de proces-industrie het bezit van speciale laboratorium faciliteiten niet realistisch is, bestond onze benadering van dit conflict tussen effektiviteit en praktische haalbaarheid uit het bouwen van een mobiel laboratorium. Dit biedt precies die faciliteiten en die beheersbare omgeving die nodig zijn voor objektief, accuraat en volledig onderzoek. Omdat het onderzoek ter plekke kan worden gedaan wordt er ook voorzien in dat niveau van toegankelijkheid en snelheid van resultaat dat vereist wordt door microbiologische ver.schijnselen.

Microbiologische technieken

Het schema van afbeelding 1 geeft een overzicht van de aan te treffen levensvormen.



Afb. 1. Onderverdeling microben.


Routine analyse
Op enkele uitzonderingen na is het over het algemeen niet nodig om de soort binnen de verschillende groepen te identificeren, omdat microbiociden zodanig zijn ontworpen dat ze een breed spectrum beslaan. De gewoonste monitoring-techniek is die van populatie tellingen van bacteriën en sulfaat reductoren.
Eén populatietelling op zich heeft geen betekenis: tellingen zijn alleen van betekenis wanneer ze aan elkaar gerelateerd worden en of er al dan niet slijm aanwezig is, om populatietrends in een gegeven systeem vast te stellen.
Bij een moeilijk probleem kan de karakterisering van een soort bereikt worden door onderzoek op een cultuur. Dit verschaft populatietellingen (in kolonies per milliliter) voor een watermonster.

De routine analyse omvat de volgende stappen:

1. Groep
1.a Totaal van de aerobe bacteriën
- Klebsiella.
- Bacillus.
- Andere potentiële slijmvormers.
- Andere aerobe bacteriën.
1.b Anaerobe bacteriën.
- Sulfaat reducerende bacteriën.
- Totaal van de anaerobe bacteriën.
1.c Micro schimmels
- Schimmels.
- Gistachtige schimmels.
- Totaal van de micro schimmels.
1.d Algen
- Groene.
- Blauw-groene.
- Kiezelalgen.


2. Opsporen/testen
2.a Totaal van de aerobe bacteriën
- Agar voedingsbodem.
Dit medium is algemeen aanvaard als een industriële standaard en wordt ook door Betz toegepast. Het onderhoudt de groei van alle aerobe bacteriën van betekenis.
2.b Slijmvormers/spore vormers
Het desbetreffende monster wordt gedurende 10 minuten verwarmd op 80 °C. Hierna blijven er sporen achter, die worden geteld.
2.c Totaal van de anaerobe bacteriën
Als medium wordt een agar voedingsbodem gebruikt.
Alle werkzaamheden vinden plaats in een anaerobe werkplek.
2.d Sulfaat reducerende bacteriën
Als medium wordt gebruik gemaaktvan reageerbuisjes met een
testmedium zoals wordt voorgeschreven voor de conserven industrie.
Werkwijze
- Anaerobe omstandigheden.
- Lange incubatie tijd (5 tot 7 dagen op 28 °C).
- Zwarte kolonies.
- Sulfaat reducerende bacteriën groeien langzaam vanwege de betrekkelijke inefficiënte van anaerobe 'ademhaling'.
2.e Microschimmels
Schimmels en gist zijn te onderscheiden aan de hand van het uiterlijk van de kolonie.
Totaal = Schimmels + Gist.
2.f Algen
Het vergt veel tijd om ze te kweken en het wordt alleen dan gedaan als er een laboratoriumbepaling nodig is voor het evalueren van een bestrijdingsgif. Hierbij moet dan worden gerekend op een kweekduur + evaluatieduur van zo'n 1 tot 3 weken. De algentelling vindt plaats met een microscoop.

Bestrijdingsmiddel evaluatie

Principe
De bestrijdingsmiddel evaluatie is een laboratoriumtest waarbij de biociden vergeleken worden onder gelijke omstandigheden. Het zijn typisch statische proeven gedurende 3 perioden van elk 24 uur waarbij het water op een constante temperatuur wordt gehouden van 32 °C. Onder deze omstandigheden kan de onderlinge werkingsgraad van de verschillende biociden vergeleken worden.
De test wordt niet gebruikt om de voedingssnelheid te bepalen. Zodra het efficiëntste biocide is gekozen, dan is de concentratie die tijdens het experiment het effektiefst was tevens de voor de koeltoren te gebruiken concentratie. Er worden monsters behandeld met bekende concentraties biocide gedurende een bepaalde periode. Na de behandeling worden de monsters op voedingsbodems geplaatst, geincubeerd en geteld. Het inhibitie percentage wordt dan berekend door de tellingen van de behandelde monsters te vergelijken met die van de controlegroep. Het inhibitie percentage(% gedood) kan bepaald worden door de volgende formule te gebruiken:



Discussie
De ervaring heeft geleerd, dat neerslagmonsters, genomen uit een te testen systeem gemengd met het koelwater, toepasselijker resultaten geven. Dit is omdat het circulatie-water vrij zwevende microorganismen bevat, en het zijn gewoonlijk de neerslagen, die de problemen geven. Daarom moeten de pogingen gericht zijn op de eliminatie van organismen die neerslag veroorzaken. Een gifstof evaluatie kan gedaan worden op de totale hoeveelheid bacteriën, schimmels, sulfaat reductoren of algen.

Neerslag-onderzoek
Neerslagproblemen kunnen veroorzaakt worden door één of meer van de volgende faktoren:

• micro-organismen
• anorganisch materiaal
• organisch materiaal

Omdat neerslagen mengsels kunnen zijn van het voornoemde in verscheidene combinaties, kan de werkelijke identifikatie van het probleem vaak ingewikkeld zijn. Microbiologische analyse van neerslagen kan opgedeeld worden in twee hoofdgebieden :

1. routine tellingen van levensvormen
2. microscopisch onderzoek.

De routine tellingen van levensvormen voor een verscheidenheid aan microscopische organismen worden uitgevoerd door gebruik te maken van de hiervoor besproken technieken. Voor microscopische observaties gebruiken we een microscoop met mogelijkheden voor fase-contrast, donker veld en verplaatsbare micrometer om de precieze meting van de specimen uit te kunnen voeren. De vergroting loopt van 150 x tot 1500 x.

Richtlijnen met betrekking tot het gehalte aan microben en chemicaliën van neerslagen

Overwegend microben slijm
Hier kan het volgende onderscheid worden gemaakt, zie afb. 2. Een kenmerk van dit slijm is een hoog gehalte aan microben. Van het slijm, dat voornamelijk wordt geassocieerd met chemische stoffen, worden kleine hoeveelheden aangetroffen in glycocalix. Slijm dat wordt gevormd door staafvormige sphaerotilus bacteriën, slijm van schimmels, algen en soms slijm van gemende microben zijn de gewoonlijk voorkomende microben slijm soorten.



Afb. 2. Samenstellingsonderscheid in microbenslijm.


Overwegend chemisch slijm
Dit slijm kan al volgt worden onderverdeeld, zie afbeelding 3. Het slijm wordt gekenmerkt door een hoog kristal gehalte. In samenhang hiermee kunnen er talrijke eencellige bacteriën aanwezig zijn. Analyse kan een onderscheid maken tussen organisch en anorgisch, hoewel de anorganische neerslagen waarschijnlijk schilferig van aard zijn.



Afb. 3. Samenstellingsonderscheid in chemisch slijm.


Mengsel van microben/chemisch slijm
Hier kan ook een onderverdeling worden aangebracht, zie afbeelding 4. Het slijm wordt gekenmerkt door een hoog gehalte aan microben en kristallen. Bindingen kunnen gewoonlijk worden toegeschreven aan zowel de microben als de chemische bestanddelen. Deze slijmtypen komen tamelijk veel voor.


Afb. 4. Samenstellingsonderscheid in microben/chemisch slijm.


Bemonstering technieken
Voor het nemen en verzenden van de monsters zijn vele speciale voorzorgen en vereisten van node. Enkele typische vereisten zijn het gebruik van steriele monster buisjes, grote monster-omvang alsmede snelle levering. Het is noodzakelijk dat elke verandering in het monster, tussen het tijdstip dat het genomen is en het tijdstip dat het ontvangen en getest wordt in het laboratorium, zo klein mogelijk wordt gehouden. Steriele buizen met boorzuur dat de bacteriegroei stopt, worden gebruikt voor bemonstering. Een recent, statistisch overzicht bevestigde een significante verbetering in de stabiliteit van de tellingen tot maximaal 3 dagen bij gebruik van boorzuur-buizen. Ondanks al deze voorzorgsmaatregelen treden er toch tot op zekere hoogte veranderingen op in de microbiologische populatie. Daarom wordt als het even kan bemonstering én testen te velde ten zeerste aanbevolen.

Biologische bewerking

De vooruitgang van biccontrole programma's kan worden gevolgd door zowel directe observatie als indirect gadeslaan.
Wat is een goede bovengrens van de bacterietelling, waaronder microbiologische controle zeker is. Omdat er zovele variaties zijn die veroorzaakt worden door bacteriële belasting, zuurgraad van het circulerende water, temperatuur, stromingssnelheden en de beschikbare voedingsstoffen, kan een specifiek getal niet worden gegeven. Het bepalen van de hoeveelheden aanwezige bacteriën zal niet helpen omdat de aanwezige overheersende fracties zullen variëren. Het gebruik van alleen totaal tellingen om biocidendosering te controleren is alleen dan bevredigend wanneer een statistisch onderzoek gehouden wordt over een
periode van een jaar of twee. Zelfs dan kunnen bijzondere gebeurtenissen het eigenlijke controle bereik veranderen. De ervaring heeft geleerd dat er gewoonlijk problemen worden ondervonden wanneer:

totaal telling > 105 col/ml
schimmels > 102 col/ml
gist > 102 col/ml

Wat is een normale hoeveelheid reducerende bacteriën in een koelsysteem en bij welke telling onstaan er problemen?
Een telling van sulfaat reducerende bacteriën tussen de 0 en 10 per milliliter is normaal voor de meeste koelsystemen. Wanneer de telling van sulfaat reducerende bacteriën boven de 10 per milliliter komt wordt het tijd om het biocide programma eens aan een nadere beschouwing te onderwerpen. Als de telling van sulfaat reducerende bacteriën groter is dan 100 per milliliter moeten definitieve stappen ondernomen worden om de biologische controle verregaand te verbeteren. Als de hoeveelheid sulfaat reducerende bacteriën toeneemt, vooral onder vorming van neerslagen, neemt de corrosiesnelheid eveneens toe. Sulfaat reductoren groeien onder neerslagen waar anaerobe condities heersen en ze produceren waterstof sulfide dat buitengewoon corrosief is.

Microbiologisch onderzoek om ter plekke een volledig microbiologisch onderzoek te doen van koelsystemen.
1 Vergaar de noodzakelijke voorafgaande informatie:
a. Stromingssnelheid in het systeem.
b. Bestudeer voorgaande onderzoeken als die er zijn.
c. Spoor huidige en vorige programma's op (biociden, chlorerings praktijken, inhibitoren etc.)
d. Spoor algemene en specifieke variabelen op (cycli, suppletie bronnen, pH, temperatuur etc.)
e. Bepaal de frequentie en de aard van de proceslekken.
f. Raak op de hoogte van milieuvoorschriften of beperkingen

2. Identificeer het probleem
a. Maak culturen en doe tellingen (totaal tellingen, schimmels, sulfaat reductoren, enz.)
b. Visueel en tastbaar onderzoek.
c. Microscopisch onderzoek van geselecteerde monsters (dek, bezinkput, neerslagen in warmtewisselaars, enz.)

3. Identifikatie van infektiepunten
a. Rangschik de getallen met die van de waterstroming, suppletievariabelen enz.
b. Houd rekening met variabelen die ontstaan gedurende het onderzoek (regen, dagen met veel wind etc.)
c. rangschik de gegevens op een zinvolle manier.

4. Bepaal de waarschijnlijk beste behandeling
a. Voer een bestrijdingsmiddel evaluatie uit op biologische neerslag die in het systeem gevonden is.
b. Rangschik deze evaluatie aan de hand van de zwakke en sterke punten als een test voor bepaalde biociden.
c. Overweeg de mogelijke problemen die bepaalde biociden kunnen geven indien deze gebruikt worden in torens (effekt in afvalwater behandelinsstystemen, afvoer in rivieren etc.)
d. Bepaal de vereiste chlorering.
e. Overweeg in geval van éénmalige systemen het uitvoeren van een tijdsafhankelijk onderzoek met verscheidene biociden.